منبع پایان نامه درباره شرایط آب و هوایی، نمونه برداری، اکسیداسیون

تنش خشکی نیز جلوگیری میشود.
فصل دوم
مواد و روشها
2-1- تجهیزات و مواد شیمیایی
2-1-1 مواد شیمیایی
ترکیبات شیمیایی مورد استفاده در انجام این پژوهش شامل: نانو کلات پتاسیم خریداری شده از شرکت خضراء، پلی اتیلن گلایکول 6000 مارک Dae Jung ساخت کشور کره، استون، متانول، معرف Folin-Ciocalteu، گالیک اسید، آلبومین سرم گاوی، کربنات سدیم، آب دیونیزه، پتاسیم استات، نین هیدرین، اسید استیک گلاسیال، اسید فسفریک، اسید سولفوسالسیلیک، اسید فسفریک، تولوئن، پرولین، تری کلرو استیک اسید و ازت مایع می باشد.
2-1-2 تجهیزات
1- اسپکتروفتومتر مدلCamSpec M501 Single Beam UV/Visible
2- انکوباتور شیکردار از شرکت Labcon
3- سانتریفیوژ مدل Sigma 1-14
4-سانتريفيوژ يخچال‌دار مدل Sigma 2KD
5- ترازوی دیجیتال با دقت (٠٠١/٠) AND-GF300
6- pH متر مدل Eutech instruments pH510
7- ورتکس
8- هيتر- استیررHP-3000
9- حمام آب گرم (بن ماری)
10- سمپلر ١٠٠٠ و ١٠٠ میكرو ليترBIOHIT
11- فریزر 70- درجه سانتیگراد
12- کوره الکتریکی Heraeus
13- فلیم امیشن اسپکترومتر مدل 310C Digital
2-1-3 ابزار و لوازم مصرفی
١- سر سمپلر (زرد 100 میکرولیتر) و آبی (1000 میکرولیتر)
٢- میکروتیوپ (5/1 میلی لیتری و 2 میلی لیتری)
3- لوله فالکن (15 میلی لیتری)
2-2 مشخصات نمونه گیاهی
در این طرح از بذرهای گیاه توتون (Nicotiana tobacum)، رقم کوکر 347 تهیه شده از مرکز تحقیقات دخانیات گیلان استفاده شد. این رقم متعلق به توتونهای برگ درشت تیپ غربی (ویرجینیا) است که از تلاقی بین کوکر 319 و کوکر 258 حاصل شده و یک رقم تجاری مناسب با شرایط آب و هوایی استانهای شمال کشور میباشد.
آماده سازی اتاق کشت
در اتاق کشت، چند قفسه چوبی تعبیه شد. برای تامین نور در قسمت بالای هر قفسه دو عدد لامپ مهتابی فلورسنت قرار گرفت. همه لامپها به یک تایمر متصل شدند تا دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی تامین شود.
شکل 2-1. نمایی از اتاقک کشت
2-4 آبیاری
در پتریدیشهای اتوکلاو شده، ابتدا دو لایه کاغذ واتمن شماره 2 گذاشته شد و بذور توتون روی کاغذها پاشیده شد. در 4 روز اول بذور توسط آب مقطر آبیاری شدند. از روز پنجم آبیاری توسط محلول هوگلند صورت گرفت.
2-5 آمادهسازی گلدانها
دو هفته پس از کاشت بذور توتون در پتریدیشها، آنها را به گلدانهایی به قطر 7 cm و ارتفاع 8 cm منتقل کردیم. انتهای گلدانها 4 سوراخ کوچک جهت انتقال محلول هوگلند ایجاد و تا اواسط آنها پرلیت ریخته شد. سپس در هر گلدان 3 یا 4 گیاهچه کاشته شد و در ظروف پلاستیکی دیگری که گنجایش حدود 1 لیتر محلول غذایی را داشتند قرار گرفتند. چون دانهرستها در پتریدیش از رطوبت بالایی برخوردار بودند، برای جلوگیری از خشکی ناگهانی آنها، روی گلدانها کیسههای پلاستیکی شفاف کشیده شد. کیسهها با بزرگ شدن گیاهان به مرور برداشته شدند. این سیستم کشت، نوعی از کشت هیدروپونیک است که در آن آبیاری بهصورت تحتانی انجام میشود. هر هفته محلول غذایی به منظور جلوگیری از نوسانات غلظت عناصر غذایی در محیط کشت و بافت گیاهی و همچنین تنظیم pH تعویض میشد. 40 روز بعد گیاهچههای رشد یافته به گلدانهای بزرگتر با قطر 30 cm و ارتفاع 40 cm که انتهای آنها نیز سوراخدار بود با شرایط قبلی انتقال یافتند و به مدت 50 روز در این گلدانها توسط محلول هوگلند آبیاری شدند.
2-5-1 تهیهی محلول هوگلند
در ابتدا طبق جدول 2-1 (الف و ب)، استوک هریک از عناصر غذایی بهصورت جداگانه تهیه شد.
جدول 2-1. الف) غلظت عناصر غذایی پرمصرف در یک لیتر استوک محلول هوگلند اصلاح شده برای رشد گیاهان
غلظت محلول استوک ( گرم در لیتر)
عناصر غذايی مورد نياز
10/101
KNO3
49/246
MgSO4.7H2O
16/236
Ca(No3)2.4H2o
08/115
NH4H2Po4
جدول 2-1.ب) غلظت عناصر غذایی کممصرف در یک لیتر استوک محلول هوگلند اصلاح شده برای رشد گیاهان
غلظت محلول استوک ( گرم در لیتر)
عناصر غذايی مورد نياز
864/1
KCl
773/0
H3BO3
169/0
MnSO4 .H2O
288/0
ZnSO4.7H2O
062/0
CuSO4.5H2O
040/0
H2MoO4(85% MoO3)
پس از تهیهی استوکها به ازای ساخت هر لیتر محلول هوگلند، مقادیر ذکر شده در جدول 2-2 (الف و ب) از استوکها برداشته شد و به حجم یک لیتر رسید. و برای هر گلدان حدود 400 میلی لیتر از این محلول استفاده شد.
جدول 2-2. الف) حجم محلول استوک عناصر غذایی پرمصرف که برای ساخت یک لیتر محلول هوگلند باید استفاده شود.
حجم برداشته شده از محلول استوک (میلیلیتر)
عناصر غذايی مورد نياز
6
KNO3
1
MgSO4.7H2O
4
Ca(No3)2.4H2o
2
NH4H2Po4
جدول 2-2. ب) حجم محلول استوک عناصر غذایی کممصرف که برای ساخت یک لیتر محلول هوگلند باید استفاده شود.
حجم برداشته شده از محلول استوک (میلیلیتر)
عناصر غذايی مورد نياز
2
KCl
2
H3BO3
2
MnSO4 .H2O
2
ZnSO4.7H2O
2
CuSO4.5H2O
2
H2MoO4(85%MoO3)
1-3/0
Na.EDTE Fe
نکات:
برای جلوگیری از رشد قارچ و جلبک، استوکها در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. طی دوره رشد گیاه، برای جلوگیری از ظهور جلبک بر روی پرلیت و محلول غذایی که یکی از مشکلات کشتهای هیدروپونیک است، اطراف ریشه دانهرستها و روی محلول غذایی، نایلونهای مشکی کشیده شد. با بزرگتر شدن گیاه این مشکل از بین میرود و نیازی به استفاده از این نایلونها نیست.
شکل 2-2. استفاده از نایلونهای مشکی در اطراف ریشهی گیاه و محلول غذایی برای جلوگیری از رشد جلبک
اعمال تنش خشکی
تنش خشکی توسط پلی اتیلن گلیکول 6000 در غلظت 20% به مدت 48 ساعت اعمال شد.
تیماردهی
پس از 48 ساعت تنش خشکی به مدت 9 روز تیماردهی به گلدانها آغاز شد. به این صورت که به گلدانهای شاهد محلول هوگلند و به سایر گلدانها نانوکلات پتاسیم در سه غلظت 15- 25 و 35 ppm بهصورت محلول دهی داده شد.
نمونهبرداری
اولین نمونه برداری قبل از اعمال تنش خشکی صورت گرفت. پس از اتمام تنش، دومین نمونهبرداری انجام شد. سایر نمونهبرداریها پس از تنش در انتهای روزهای سوم، ششم و نهم از هر یک از تیمارها صورت گرفت. برگها بهصورت تصادفی در فاصله میان گرههای دوم و سوم چیده شدند و داخل فویل قرار داده شدند. نمونهها پس از فریز شدن داخل ازت مایع، به فریزر 70- منتقل و تا زمان آنالیز نگهداری شدند.
2-9 سنجش پرولین
جهت اندازهگیری پرولین مطابق روش بتس و همکاران Bates, et al. 1973)) انجام شد. این روش بر اساس تشکیل یک ترکیب رنگی در اثر واکنش میان اسید آمینه پرولین آزاد و معرفی به نام ناین هیدرین (با فرمول C9H6O4 و جرم مولکولی 15/178 گرم بر مول) در شرایط اسیدی و دمای 100 درجه سانتیگراد و سپس تخلیص این ترکیب رنگی به کمک یک حلال آلی غیر قطبی مانند تولوئن استوار است. در اثر ترکیب پرولین و ناین هیدرین، مادهای رنگی به نام دی کتوهیدرین دیلیدین ایجاد میشود. شدت رنگ این ترکیب وابسته به مقدار پرولین میباشد و با اندازهگیری جذب نوری میتوان به مقدار پرولین پی برد. در این آزمایش ابتدا 5/0 گرم ماده تر گیاهی در 5 میلی لیتر محلول 3 درصد سولفوسالیسیلیک اسید ساییده شد. پس از صاف نمودن مخلوط با کاغذ صافی واتمن شماره 2، 2 میلی لیتر از آن در لوله آزمایش ریخته و 2 میلی لیتر معرف اسید نین هیدرین (25/1گرم نین هیدرین در اسید استیک20درصد) و 2 میلی لیتر اسید استیک خالص به آن اضافه گردید. لولهها به مدت یک ساعت در بن ماری دمای100 درجه قرار گرفتند و سپس به حمام یخ منتقل شدند. آنگاه 4 میلی لیتر تولوئن به هر لوله اضافه شد و پس از تکان دادن لولهها، مدت 20 ثانیه ثابت نگه داشته شدند تا اینکه دو لایه مجزا تشکیل شد. سرانجام جذب لایه فوقانی (حاوی تولوئن و پرولین) در طول موج 520 نانومتر خوانده شد و مقدار پرولین با استفاده از منحنی استاندارد تعیین شد.
منحنی استاندارد با در دست داشتن غلظتهای مختلف پرولین و جذب هر کدام از غلظتها رسم و معادله منحنی استاندارد بهدست آمد.
منحنی استاندارد پرولین
2-10 سنجش پروتئين کل به روش برادفورد
2-10-1 تهية معرف1 برادفورد:
معرف برادفورد شامل100میلی گرم پودر كوماسي بريليانت بلو G-250 ،50 میلی گرم اتانول 96%. 100میلی لیتر اسید فسفریک (w/w)85 درصد می باشد. این سه ماده را با هم مخلوط کرده و به حجم ml 200 میرسانیم. به این ترتیب محلول x5 بهدست میآید که باید در ظرف تیره نگهداری شود. در زمان آزمایش، محلول فوق را 5 بار رقیق میکنیم تا محلول x1 بهدست آید.
براي تهيه محلول استوك mg/ml1 آلبومين سرم گاوي (BSA)، مقدار معيني (1میلی گرم) از اين پروتئين را در 1 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و در زمان استفاده آن را ده برابر رقيق ميکنیم. حال از اين غلظت در لوله‏هاي آزمايش بهترتيب0، 5، 10، 15، 20، 25، 30 و 35 و40و 45 ماکرولیتر BSA میریزیم و با آب مقطر به حجم 50 میرسانیم و به هر كدام ml 5/2 محلول برادفورد x1 با رعایت فاصلهی زمانی 2 دقیقه اضافه مي‏كنيم و به مدت 25-30 ثانیه لولهها را ورتکس میکنیم. بعد از 15 دقیقه جذب لولهها در طول موج 595 نانومتر با ر عایت همان مقدار فاصلهی زمانی با اسپکتروفتومتر میخوانیم. به این ترتیب منحنی استاندارد (جذب علیه (mg/ml)BSA)رسم شده و به کمک آن و با استفاده از شیب خط منحنی، غلظت پروتئین کل محاسبه شد.
2-11 سنجش كلروفيل و كاروتنوئيد
5/0 گرم برگ تر از هر تکرار توزین شده و توسط نیتروژن مایع در داخل هاون چینی آسیاب شد و به آن 5 میلیلیتر استون 80 درصد (20 آب مقطر: 80 استون) اضافه گردید. مخلوط به دست آمده به مدت 15 دقیقه با دور (rpm)3000 در دماي ٤ درجه سلسيوس سانتریفیوژ گردید. در نهایت عصاره استونی شفاف جدا شده و حجم آن با استون خالص به 5 میلی لیتر (حجم اولیه) رسانده شد. سپس شدت جذب محلول در طول موجهاي 470، 646 و 663 با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر (CamSpec M501 UV/Visible) در مقابل شاهد قرائت شد. در نهایت برای تعیین مقدار کلروفیل و همچنین کاروتنوئید کل از فرمولهای زیر استفاده شد (Lichtenthaler, 1987).
Chl.a= (12.25 A663–2.79 A646) ×V/W
Ch1.b=(21.50 A646–5.1 A663)×V/W
Chl.T= Chl.a + Chl.b
Car.=(1000 A470 – 1.82 Chl.a – 85.02 Chl.b)/198×V/W
كه در روابط بالا V حجم استن به ميلي ليتر و W وزن تر برگ بر حسب گرم مي‌باشد. غلظت کلروفیل و کاروتنوئید کل برحسب ميلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ میباشد.
2-12 اندازهگیری مالون دی آلدهید
برای این منظور 5/0 گرم از بافت برگ در هر تکرار با ml5 تری کلرواستیک اسید 5% ساییده شد. عصاره حاصل، به مدت 15 دقیقه، در دمای اتاق و با دور rpm)) 14000 سانتریفیوژ شده و سپس محلول رویی توسط سمپلر جدا شد. پس از آن به حجم مساوی از محلول رویی (سوپرناتانت) TCA20درصد حاوی5/0 درصد TBA افزوده گردید. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در حمام آب جوش با دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده و بلافاصله درظرف یخ سرد شد؛ سپس 2000 میکرولیتر از سوپرناتانت به میکرتیوپ منتقل و به مدت 5 دقیقه در دور rpm)) 7500 سانتریفیوژ شد. سپس جذب کمپلکس MDA+TBA در nm 532 قرائت شد. جذب بقیه رنگیزههای غیراختصاصی در nm 600 تعیین شد و از میزان جذب در nm 532 کسر گردید. برای محاسبه غلظتMDA از ضریب خاموشی mM-1cm-1155 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون دی آلدهید که محصول واکنش پراکسیداسیون لیپیدهاست، بر اساس نانو مول در گرم وزن تر محاسبه شد.
2-13 استخراج آنتی اکسیدانهای غیرآنزیمی
به منظور استخراج عصاره آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی مثل فنل از متانول 80% استفاده شد. ابتدا برگ توتون را به مدت 24 ساعت در دمای 38 درجه سانتیگراد در

تکه های دیگری از این پایان نامه را می توانید

در شماره بندی فوق بخوانید

متن کامل پایان نامه ها در سایت homatez.com موجود است

You may also like...

Add a Comment